solarbio質粒提取試劑盒簡介 說明
更新時間：2010-10-24 | 點擊率：8975
質粒提取試劑盒簡介
質粒（Plasmid）是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。
質粒提取原理及流程
較常用的質粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質粒（>15kb）。
堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在回到中性時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋自質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質粒DNA。
目前，市面上質粒提取試劑盒大多數都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統是硅基質吸附材料，其原理為在高鹽環境下質粒DNA能夠結合到硅基質上，然后用低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質粒可以用于酶切、PCR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
影響質粒提取的因素
質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。
宿主菌種類
質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，多數情況下我們是從大腸桿菌中提取質粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質粒提取的質量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質量的質粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。另外，有些菌株有非常高的內切酶活性，會降低DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質粒DNA。
培養時間
從固體培養基平板上挑取一個單菌落，接種到培養物中（含有相關抗生素的液體培養基中），振蕩培養12-16小時。不應超過16小時，因為這時細胞開始裂解，使得質粒的得率降低，也會導致質粒丟失或質粒變異。
質粒擴增
氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成，但對松弛型質粒的復制沒有影響。因此，在細菌培養液中加入氯霉素可提高松弛型質粒的拷貝數。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成，從而抑制了染色體的復制，但質粒復制所用的酶半衰期較長，故質粒仍可繼續復制，這樣既可增加質粒產量，又可降低細胞的數量，使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生長階段都應加入抗生素篩選。現在用的許多質粒都不含有在細胞分裂時確保平均分配的par位點，無質粒的子細胞在無抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。
幾種常用抗生素的濃度
| 抗生素 | 儲存濃度 | 保存條件 | 嚴緊型質粒工作濃度 | 松弛型質粒工作濃度 |
| 氨芐青霉素 | 50mg/ml（溶于水） | -20℃ | 20ug/ml | 100ug/ml |
| 羧芐青霉素 | 50mg/ml（溶于水） | -20℃ | 20ug/ml | 100ug/ml |
| 氯霉素 | 34mg/ml（溶于無水乙醇） | -20℃ | 34ug/ml | 170ug/ml |
| 卡那霉素 | 10mg/ml（溶于水） | -20℃ | 10ug/ml | 50ug/ml |
| 鏈霉素 | 10mg/ml（溶于水） | -20℃ | 10ug/ml | 50ug/ml |
| 四環素 | 5mg/ml（溶于無水乙醇） | -20℃ | 10ug/ml | 50ug/ml |
質粒拷貝數
質粒拷貝數常用的定義是指生長在標準的培養基下每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數目。每個細胞中的質粒數主要決定于質粒本身的起始復制機制。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有1-2個質粒，如F因子；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒，如ColEl質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型，分子量較小的質粒屬松弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬松弛型。
部分質粒的拷貝數
| 質粒種類 | 拷貝數 | 起始復制子 | 類型 |
| pUC18/19載體 | 500-700 | pMB1 | 高拷貝 |
| pBluescript載體 | 300-500 | ColE1 | 高拷貝 |
| pGEM-T載體 | 300-400 | pMB1 | 高拷貝 |
| pTZ載體 | >1000 | pMB1 | 高拷貝 |
| pBR322載體 | 15-20 | pMB1 | 低拷貝 |
| pACYC及其衍生載體 | 10-122 | p1 | 低拷貝 |
| pSC101及其衍生載體 | 5 | pSC101 | 低拷貝 |
菌液收集及裂解
細菌收集可以通過離心來進行，不同的質粒拷貝數，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質粒，要相應增加菌液的量。菌液是在堿性環境下裂解的，由于不同的宿主菌細胞壁厚薄的差異，細胞的破壁程度不同，對于細胞壁較厚的宿主菌，首先要進行破壁處理：
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集、重懸以及宿主菌細胞破壁后，細胞在含有RNase A的NaOH/SDS（溶液P2）中裂解。SDS溶解細胞膜的磷脂和蛋白成分，使細胞的內容物如染色體、質粒DNA和蛋白在堿性環境下變性。佳的裂解時間是質粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時間，盡量縮短質粒暴露在變性環境中。長時間處在堿性環境中會導致質粒發生不可恢復的變性。變性的質粒在瓊脂糖膠上跑的較快，而且不能被限制性內切酶消化。裂解產物在溶液P3中被調整到中性高鹽環境，高鹽使得變性的蛋白、染色體DNA、細胞碎片和SDS都沉淀下來，而質粒復性留在上清溶液中。溶液要*、混勻以確保沉淀*。為了防止染色體DNA污染質粒DNA，要避免劇烈振蕩，以防止染色體DNA被打斷，造成對質粒DNA的污染。因為染色體DNA的片段和質粒DNA在高鹽條件下，都可以與硅膠膜結合，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗脫下來。因此，在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。
質粒DNA分離和純化
純化要求
質粒DNA中不應存在對后續實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。
不同的后續實驗對于質粒純度的要求不同，常規的分子生物學實驗（如酶切、測序等）普通純度的質粒即可滿足實驗，而對于轉染實驗，要求質粒的純度較高（如高純度或無內毒素）。可以選擇不同的質粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。
純化方法
用硅基質材料吸附質粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質粒提取試劑盒和無內毒素質粒提取試劑盒。
質粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
質粒的保存
溶解在洗脫液EB中的質粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶解的質粒只能短期保存，因為實驗室用的純水呈弱酸性，質粒在酸性環境下會發生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保存，也可在含有質粒的細菌培養物中，加等體積甘油，于-70℃保存
質粒鑒定與評價
瓊脂糖電泳檢測
堿裂解法提取的質粒經瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現超螺旋—條帶，但在質粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等原因，使質粒DNA鏈發生斷裂，可能出現兩條帶或者出現三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制*的兩個質粘連在—起）。如果加溶液P2后過度振蕩，會在遠離這三條帶的位置出現條帶，這條帶泳動得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候提取的質粒會出現4個以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。但是，只要質粒經單酶切鑒定后，只有單一條帶，就證明沒有基因組的污染。
酶切檢測
質粒提取后，為了進—步鑒定質粒的正確與否，就要進行酶切鑒定，通過與Marker對比，確定質粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計檢測
濃度測定標準為：OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子濃度會影響光吸收值，但并不表示純度低。
質粒小量提取試劑盒
| 目錄號 | 包裝 | 價格 | 產地 |
| D1100-50 | 50次 | 元 | Solarbio |
| D1100-100 | 100次 | 160元 | Solarbio |
產品簡介：
本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，通過吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA的特性提取質粒DNA。吸附柱中采用的硅基質材料能、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。從1-5ml大腸桿菌LB培養液中，可快速提取5-15μg純凈地高拷貝質粒DNA，提取率達85-90％。使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學試驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。
產品包裝：
| 試劑盒組成 | D1100-50 | D1100-100 | 儲存條件 |
| RNase A | 150ul | 300ul | -20℃ |
| 溶液Ⅰ | 15ml | 30ml | RT |
| 溶液Ⅱ | 15ml | 30ml | RT |
| 溶液Ⅲ | 20ml | 40ml | RT |
| 漂洗液 | 15ml | 15ml×2 | RT |
| 洗脫液 | 10ml | 20ml | RT |
| 吸附柱 | 50個 | 100個 | RT |
| 收集管 | 50個 | 100個 | RT |
| 說明書 | 1份 | 1份 | RT |
注意事項：
1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。
2、*次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液（如向15ml的漂洗液中加入60ml的無水乙醇）。
3、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。
4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心。
5、如果是提取革蘭氏陽性菌質粒，必須在裂解細胞前破細胞壁，方法如下：收集適量菌體，加入250ul溶液Ⅰ，充分懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度為10-20mg/ml，37℃處理30min左右。加入溶菌酶的濃度和處理時間可根據不同的菌株和具體試驗條件進行調整。
6、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右（可用NaOH將水的pH值調至此范圍），pH值低于7.0會降低洗脫效率。
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